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Mise en commun pour qPCR

Mise en commun pour qPCR


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Je compare les niveaux d'expression des miARN dans 3 groupes différents, mais je manque d'argent et de temps. Je dois obtenir des résultats préliminaires pour lancer la recherche réelle. J'ai donc décidé de regrouper mes échantillons et d'obtenir les résultats pour 372 miARN, puis si l'un d'entre eux présente une expression différentielle importante, j'étudierai les niveaux d'expression de ces miARN candidats groupes. Mais je ne peux pas décider comment regrouper mes échantillons pour la mise en commun. Dois-je choisir 3 échantillons individuels pour chacun des 3 groupes (9 échantillons au total) ou dois-je extraire l'ARN total de chaque échantillon pour chaque groupe, faire 3 pools d'ARN, puis effectuer des triples pour chaque pool ? Le temps et l'argent dépensés dans les deux situations seront les mêmes. Je pense que la deuxième méthode est plus appropriée, mais je crains qu'elle ne produise des valeurs p dégonflées, entraînant une fausse découverte.


Dois-je choisir 3 échantillons individuels pour chacun des 3 groupes (9 échantillons au total) ou dois-je extraire l'ARN total de chaque échantillon pour chaque groupe, faire 3 pools d'ARN, puis effectuer des triples pour chaque pool ?

Dépend de la nature de vos échantillons. En général, la mise en commun permettrait de moyenner l'expression de différents individus. La mise en commun est généralement effectuée lorsque vous avez un faible rendement d'ARN par échantillon individuel. Si ce n'est pas le cas, vous devriez échantillonner plusieurs individus par groupe (trois devraient être parfaits, plus c'est mieux). Cela vous permettra de connaître la variation interindividuelle/échantillon au sein d'un groupe. Vous pouvez à son tour configurer trois répétitions techniques pour la qPCR afin de mesurer la variation technique. Donc, au total, vous auriez 27 réactions PCR. Cela ne serait pas très coûteux (à moins que vous n'utilisiez un test similaire à TaqMan. Même dans ce cas, travailler parfois avec un plus grand nombre d'échantillons vous permet d'économiser la quantité de réactif utilisée par échantillon.


Principes de base de la RT-qPCR

La PCR quantitative de transcription inverse (RT-qPCR) est utilisée lorsque le matériel de départ est de l'ARN. Dans cette méthode, l'ARN est d'abord transcrit en ADN complémentaire (ADNc) par transcriptase inverse à partir d'ARN total ou d'ARN messager (ARNm). L'ADNc est ensuite utilisé comme matrice pour la réaction qPCR. La RT-qPCR est utilisée dans diverses applications, notamment l'analyse de l'expression génique, la validation de l'ARNi, la validation des puces à ADN, la détection d'agents pathogènes, les tests génétiques et la recherche sur les maladies.

RT-qPCR en une étape ou en deux étapes

La RT-qPCR peut être réalisée en une étape ou en deux étapes (Figure 1, Tableau 1). Les tests en une étape combinent la transcription inverse et la PCR dans un seul tube et tampon, en utilisant une transcriptase inverse avec une ADN polymérase. La RT-qPCR en une étape utilise uniquement des amorces spécifiques à la séquence. Dans les tests en deux étapes, les étapes de transcription inverse et de PCR sont effectuées dans des tubes séparés, avec différents tampons optimisés, conditions de réaction et stratégies d'amorçage.

Figure 1. RT-qPCR en une étape ou en deux étapes.

Tableau 1. Avantages et inconvénients lors de l'utilisation de tests en une étape ou en deux étapes en RT-qPCR

  • Moins de variation expérimentale puisque les deux réactions ont lieu dans le même tube
  • Moins d'étapes de pipetage réduit le risque de contamination
  • Convient pour l'amplification/le criblage à haut débit
  • Rapide et hautement reproductible
  • Impossible d'optimiser les deux réactions séparément
  • Moins sensible qu'en deux étapes car les conditions de réaction sont un compromis entre les deux réactions combinées
  • Détection de moins de cibles par échantillon
  • Un pool d'ADNc stable est généré qui peut être stocké pendant de longues périodes et utilisé pour de multiples réactions
  • Les gènes cibles et de référence peuvent être amplifiés à partir du même pool d'ADNc sans multiplexage
  • Des tampons de réaction optimisés et des conditions de réaction peuvent être utilisés pour chaque réaction individuelle
  • Options d'amorçage flexibles
  • L'utilisation de plusieurs tubes et étapes de pipetage expose la réaction à un plus grand risque de contamination de l'ADN
    Long
  • Nécessite plus d'optimisation qu'une seule étape

Choisir l'ARN total par rapport à l'ARNm

Lors de la conception d'un test RT-qPCR, il est important de décider s'il faut utiliser l'ARN total ou l'ARNm purifié comme matrice pour la transcription inverse. L'ARNm peut fournir un peu plus de sensibilité, mais l'ARN total est souvent utilisé car il présente des avantages importants par rapport à l'ARNm en tant que matériau de départ. Premièrement, moins d'étapes de purification sont nécessaires, ce qui garantit une récupération plus quantitative de la matrice et une meilleure capacité à normaliser les résultats par rapport au nombre de cellules de départ. Deuxièmement, en évitant toute étape d'enrichissement d'ARNm, on évite la possibilité de résultats faussés en raison de rendements de récupération différents pour différents ARNm. Pris ensemble, l'ARN total est plus approprié à utiliser dans la plupart des cas puisque la quantification relative des cibles est plus importante pour la plupart des applications que la sensibilité absolue de la détection 1 .

Abécédaires pour la transcription inverse

Trois approches différentes peuvent être utilisées pour amorcer des réactions d'ADNc dans des dosages en deux étapes : amorces oligo(dT), amorces aléatoires ou amorces spécifiques à la séquence (Figure 2, Tableau 2). Souvent, un mélange d'oligo(dT)s et d'amorces aléatoires est utilisé. Ces amorces s'hybrident au brin d'ARNm matrice et fournissent aux enzymes de la transcriptase inverse un point de départ pour la synthèse.

Figure 2. Quatre méthodes d'amorçage différentes pour l'étape de transcription inverse dans les dosages en deux étapes de la RT-qPCR.

Tableau 2. Considérations sur les amorces pour l'étape de synthèse d'ADNc de la RT-qPCR. La combinaison d'amorces aléatoires et d'amorces oligo(dT) ancrées améliore l'efficacité de la transcription inverse et la sensibilité de la qPCR.

  • Génération d'ADNc complet à partir d'ARNm à queue poly(A)
  • Bon à utiliser si peu de matière première est disponible
  • L'ancre garantit que l'amorce oligo(dT) se lie à l'extrémité 5' de la queue poly(A) de l'ARNm
  • Amplifier uniquement le gène avec une queue poly(A)
  • ADNc tronqué provenant des sites internes poly(A) d'amorçage*2
  • Biais vers l'extrémité 3′*
  • Recuit à tous les ARN (ARNt, ARNr et ARNm)
  • Bon à utiliser pour les transcriptions avec des structures secondaires importantes, ou si peu de matériel de départ est disponible
  • Rendement élevé d'ADNc
  • L'ADNc est fabriqué à partir de tous les ARN, ce qui n'est pas toujours souhaitable et peut diluer le signal de l'ARNm
  • ADNc tronqué
  • Pool d'ADNc spécifique
  • Sensibilité accrue
  • Utiliser une amorce de qPCR inversée
  • La synthèse est limitée à un gène d'intérêt

Enzymes de la transcriptase inverse

La transcriptase inverse est l'enzyme qui fabrique l'ADN à partir de l'ARN. Certaines enzymes ont une activité RNase pour dégrader le brin d'ARN dans l'hybride ARN-ADN après transcription. Si une enzyme ne possède pas d'activité RNase, une RNaseH peut être ajoutée pour une meilleure efficacité qPCR. Les enzymes couramment utilisées comprennent la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney et la transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire. Pour la RT-qPCR, il est idéal de choisir une transcriptase inverse avec une stabilité thermique élevée, car cela permet d'effectuer la synthèse d'ADNc à des températures plus élevées, assurant une transcription réussie de l'ARN avec des niveaux élevés de structure secondaire, tout en maintenant leur pleine activité tout au long de la réaction produisant des rendements d'ADNc plus élevés.

Activité RNase H de la transcriptase inverse

L'activité RNase H dégrade l'ARN des duplex ARN-ADN pour permettre une synthèse efficace de l'ADN double brin. Cependant, avec de longues matrices d'ARNm, l'ARN peut être dégradé prématurément, ce qui entraîne un ADNc tronqué. Par conséquent, il est généralement avantageux de minimiser l'activité de la RNase H lorsque l'on vise à produire de longs transcrits pour le clonage d'ADNc. En revanche, les transcriptases inverses avec une activité RNase H intrinsèque sont souvent favorisées dans les applications qPCR car elles améliorent la fusion du duplex ARN-ADN au cours des premiers cycles de PCR (figure 3).

Figure 3. RNase H Activité des transcriptases inverses. En qPCR, utilisez une transcriptase inverse avec une activité RNAse.


PCR, qPCR - Bibliographies de biologie - à la Harvard

Votre bibliographie : Bunnell, T., Burbach, B., Shimizu, Y. et Ervasti, J., 2011. - L'actine contrôle spécifiquement la croissance cellulaire, la migration et le pool de G-actine. Biologie moléculaire de la cellule, 22(21), pp.4047-4058.

Campbell, N.A. et Reece, J.B.

La biologie

2005 - Pearson, Benjamin Cummings - San Francisco

Dans le texte : (Campbell et Reece, 2005)

Votre bibliographie : Campbell, N. et Reece, J., 2005. La biologie. San Francisco : Pearson, Benjamin Cummings.

L'homme, P.

Réaction en chaîne par polymérase : quelle importance a-t-elle ?

Dans le texte : (Homme, 2015)

Votre bibliographie : Homme, P., 2015. Réaction en chaîne par polymérase : quelle importance a-t-elle ?. [en ligne] Info.gbiosciences.com. Disponible sur : <http://info.gbiosciences.com/blog/bid/172095/Polymerase-Chain-Reaction-What-Importance-Does-It-Hold> [Consulté le 17 décembre 2015].

Electrophorèse sur gel de produits PCR | Diagnostic national

Dans le texte : (Électrophorèse sur gel de produits PCR | National Diagnostics, 2015)

Votre bibliographie : Nationaldiagnostics.com. 2015. Electrophorèse sur gel de produits PCR | Diagnostic national. [en ligne] Disponible sur : <https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/gel-electrophoresis-pcr-products> [Consulté le 16 décembre 2015].

Comprendre et mesurer les variations de la qualité des échantillons d'ADN

Dans le texte : (Comprendre et mesurer les variations de la qualité des échantillons d'ADN, 2015)

Votre bibliographie : Ogt.co.uk. 2015. Comprendre et mesurer les variations de la qualité des échantillons d'ADN. [en ligne] Disponible sur : <http://www.ogt.co.uk/resources/literature/483_understanding_and_measuring_variations_in_dna_sample_quality> [Consulté le 16 décembre 2015].

Packwood, T.

Dans le texte : (Packwood, 2015)

Votre bibliographie : Packwood, T., 2015. PCR. [en ligne] Geneticseducation.nhs.uk. Disponible sur : <http://www.geneticseducation.nhs.uk/laboratory-process-and-testing-techniques/pcr> [Consulté le 16 décembre 2015].

QPCR vs PCR numérique vs PCR traditionnelle | Thermo Fisher Scientific

Dans le texte : (qPCR vs. PCR numérique vs. PCR traditionnelle | Thermo Fisher Scientific, 2015)


Évaluation du test COVID-19 RT-qPCR dans des pools d'échantillons multiples

L'émergence récente du SRAS-CoV-2 a conduit à une pandémie actuelle de niveaux sans précédent. Bien que les tests de diagnostic soient fondamentaux pour détecter et réagir, de nombreux systèmes de santé connaissent déjà des pénuries de réactifs associés à ce test. Ici, en testant une approche de mise en commun pour le test RT-qPCR standard, nous constatons qu'un seul échantillon positif peut être détecté même dans des pools de 32 échantillons maximum, avec un taux de faux négatifs estimé à 10 %. La détection d'échantillons positifs dilués dans jusqu'à 64 échantillons peut également être obtenue, mais peut nécessiter des cycles d'amplification supplémentaires. Utilisant les protocoles, réactifs et équipements standards, cette méthode de mise en commun peut être appliquée immédiatement dans les laboratoires d'essais cliniques actuels. Nous espérons qu'une telle mise en œuvre d'un test de pool pour COVID-19 permettrait d'étendre les capacités de dépistage actuelles, permettant ainsi l'expansion de la détection dans la communauté, ainsi que dans des groupes intégraux étroits, tels que les services hospitaliers, les unités de l'armée ou les équipes d'usine.

Déclaration d'intérêts concurrents

Les auteurs n'ont déclaré aucun intérêt concurrent.

Déclaration de financement

Yad Hanadiv - La Fondation Rothschild en Israël

Déclarations de l'auteur

Toutes les directives éthiques pertinentes ont été suivies, toutes les approbations nécessaires de l'IRB et/ou du comité d'éthique ont été obtenues et les détails de l'IRB/de l'organisme de surveillance sont inclus dans le manuscrit.

Tout le consentement nécessaire du patient/participant a été obtenu et les formulaires institutionnels appropriés ont été archivés.

Je comprends que tous les essais cliniques et toute autre étude interventionnelle prospective doivent être enregistrés auprès d'un registre approuvé par l'ICMJE, tel que ClinicalTrials.gov. Je confirme qu'une telle étude rapportée dans le manuscrit a été enregistrée et que l'ID d'enregistrement de l'essai est fourni (remarque : si vous publiez une étude prospective enregistrée rétrospectivement, veuillez fournir une déclaration dans le champ ID de l'essai expliquant pourquoi l'étude n'a pas été enregistrée à l'avance) .

J'ai suivi toutes les directives de rapport de recherche appropriées et téléchargé la ou les listes de contrôle de rapport de recherche du réseau EQUATOR pertinentes et d'autres documents pertinents en tant que fichiers supplémentaires, le cas échéant.


Stratégies de mise en commun pour les tests COVID-19

David Austin
Université d'État de Grand Valley
Envoyer un courriel à David Austin

Bien que la pandémie de COVID-19 ait provoqué des tragédies et des perturbations, elle a également fourni une occasion unique aux mathématiques de jouer un rôle important et visible dans la résolution d'un problème urgent auquel notre société est confrontée.

À présent, il est bien compris que les tests sont un élément crucial de toute stratégie efficace pour contrôler la propagation du coronavirus SARS-CoV-2. Les pays qui ont mis au point des régimes de test efficaces ont pu, dans une plus grande mesure, reprendre leurs activités normales, tandis que ceux dont les tests étaient inadéquats ont vu le coronavirus persister à des niveaux dangereusement élevés.

Développer une stratégie de test efficace signifie faire face à des défis importants. L'un produit et administre suffisamment de tests pour former une image précise de l'état actuel de la propagation du virus. Cela signifie qu'il faut disposer d'un nombre suffisant de professionnels de la santé formés pour collecter et traiter les échantillons, ainsi que d'un approvisionnement adéquat en réactifs et en machines de test. De plus, les résultats doivent être disponibles rapidement. Une personne infectée sans le savoir peut transmettre le virus à de nombreuses autres en une semaine, les résultats doivent donc être disponibles en quelques jours, voire quelques heures.

Une façon de relever ces défis de ressources limitées et de temps limité consiste à combiner des échantillons de nombreux patients dans des pools de tests de manière stratégique plutôt que de tester des échantillons de chaque patient séparément. En effet, certaines stratégies de pooling bien conçues peuvent diminuer le nombre de tests requis d'un facteur dix, c'est-à-dire qu'il est possible de tester efficacement, disons, 100 patients avec un total de 10 tests.

À première vue, il peut sembler que nous tirons quelque chose de rien. Comment 10 tests pourraient-ils donner des résultats précis pour 100 patients ? Cette colonne décrira comment certaines idées mathématiques de la théorie de la détection compressée fournissent la clé.

L'une des caractéristiques intéressantes de la pandémie de COVID-19 est la vitesse à laquelle nous en apprenons. Le public voit la science réalisée en public et en temps réel, et de nouvelles découvertes nous amènent parfois à modifier des recommandations et des comportements antérieurs. Cela a rendu le travail de communication des découvertes scientifiques particulièrement délicat. Ainsi, même si certains éléments de cet article peuvent nécessiter une mise à jour dans un proche avenir, notre objectif est plutôt de nous concentrer sur des problèmes mathématiques qui doivent rester pertinents et de faire confiance au lecteur pour les mettre à jour le cas échéant.

Quelques stratégies de mutualisation simples

Alors que le virus SARS-CoV-2 est nouveau, le problème de tester des individus dans une grande population ne l'est pas. Notre histoire commence en 1943 lorsque Robert Dorfman a proposé la méthode simple suivante pour identifier les hommes syphilitiques appelés à être intronisés par le biais de la conscription en temps de guerre.

Une affiche de 1941 encourage le dépistage de la syphilis (Bibliothèque du Congrès)

Supposons que nous ayons des échantillons de, disons, 100 patients. Plutôt que de tester chacun des échantillons individuellement, Dorfman a suggéré de les regrouper en 10 groupes de 10 chacun et de tester chaque groupe.

Si le résultat du test d'un pool est négatif, nous concluons que tout le monde dans ce pool est indemne d'infection. Si un pool est testé positif, nous testons chaque individu du pool.

Dans la situation illustrée ci-dessus, deux des 100 échantillons sont infectés, nous effectuons donc un total de 30 tests pour les identifier : 10 tests pour les 10 pools d'origine suivis de 20 tests pour chaque membre des deux pools infectés. Ici, le nombre de tests effectués est de 30% du nombre requis si nous avions testé chaque individu séparément.

Bien sûr, il y a des situations où cette stratégie est désavantageuse. S'il y a une personne infectée dans chaque piscine, nous finissons par effectuer les 10 tests d'origine et faisons un suivi en testant ensuite chaque individu. Cela signifie que nous effectuons 110 tests, plus que si nous venions de tester chacun séparément.

Ce qui est important, c'est le prévalence $p$ de l'infection, la fraction attendue d'individus infectés que nous nous attendons à trouver ou la probabilité qu'un individu aléatoire soit infecté. Si la prévalence est faible, il semble raisonnable que la stratégie de Dorfman puisse conduire à une réduction du nombre de tests que nous nous attendons à effectuer. Cependant, à mesure que la prévalence augmente, il peut ne plus être efficace.

Il n'est pas trop difficile de déterminer comment le nombre attendu de tests par personne varie avec la prévalence. Si nous organisons $k^2$ échantillons en $k$ pools de $k$ échantillons chacun, alors le nombre attendu de tests par personne est $ E_k = frac1k + (1-(1-p)^k). $ Lorsque $k=10$, le nombre attendu $E_<10>$ est affiché à droite. Bien sûr, tester chaque individu séparément signifie que nous utilisons un test par personne, donc la stratégie de Dorfman perd son avantage lorsque $E_kgeq 1$. Comme le montre le graphique, lorsque $p>0.2$, ce qui signifie qu'il y a plus de 20 infections pour 100 personnes, nous ferions mieux de tester chaque individu.

Heureusement, la prévalence des infections au SRAS-CoV-2 est relativement faible dans la population générale. Au début du semestre d'automne, mon université a lancé un programme de tests randomisés qui a montré que la prévalence dans la communauté du campus était d'environ $papprox 0,01$. L'inquiétude s'installe maintenant que ce nombre est plus proche de 0,04. Dans tous les cas, nous supposerons que la prévalence des individus infectés dans notre population est suffisamment faible pour faire de la mutualisation une stratégie viable.

Bien sûr, aucun test n'est parfait. Il est possible, par exemple, qu'un échantillon infecté donne un résultat de test négatif. Il est typique de caractériser l'efficacité d'un protocole de test particulier à l'aide de deux mesures : sensibilité et spécificité. La sensibilité mesure la probabilité qu'un test renvoie un résultat positif pour un échantillon infecté. De même, la spécificité mesure la probabilité qu'un test renvoie un résultat négatif lorsque l'échantillon n'est pas infecté. Idéalement, ces deux chiffres sont proches de 100 %.

En utilisant la méthode de mise en commun de Dorfman, le prix que nous payons pour abaisser le nombre attendu de tests en dessous d'un est une diminution de la sensibilité. L'identification d'un échantillon infecté dans ce processus en deux étapes nécessite que le test renvoie correctement un résultat positif à chaque fois que nous le testons. Par conséquent, si $S_e$ est la sensibilité d'un seul test, la méthode de Dorfman a une sensibilité de $S_e^2$. Par exemple, un test avec une sensibilité de 95 % donne une sensibilité d'environ 90 % lorsque les tests sont regroupés.

Il y a cependant une augmentation de la spécificité. Si un échantillon n'est pas infecté, un deuxième test augmente les chances de le détecter comme tel. On peut montrer que si la sensibilité et la spécificité sont d'environ 95% et la prévalence à 1%, alors le regroupement de 10 échantillons, comme indiqué ci-dessus, augmente la spécificité à environ 99%.

Quelques modifications de la méthode Dorfman

Il est possible d'imaginer modifier la méthode de Dorfman de plusieurs manières. Par exemple, une fois que nous avons identifié les pools infectés lors de la première série de tests, nous pourrions appliquer une stratégie de regroupement sur le plus petit ensemble d'échantillons qui nécessitent encore des tests.

Une deuxième possibilité est illustrée ci-dessous où 100 échantillons sont imaginés dans un tableau carré de 10$x10$. Chaque échantillon est inclus dans deux pools selon sa ligne et sa colonne de sorte qu'un total de 20 tests soient effectués au premier tour. Dans l'illustration, les deux échantillons infectés conduisent à des résultats positifs dans quatre des pools, deux lignes et deux colonnes.

On sait que les échantillons infectés apparaissent à l'intersection de ces deux lignes et deux colonnes, ce qui conduit à un total de quatre tests au second tour. Encore une fois, il est possible d'exprimer $E_k$, le nombre de tests attendus par individu en termes de prévalence $p$. Si nous avons $k^2$ tests arrangés dans un tableau $k imes k$, nous voyons que $ E_k =frac2k + p + (1-p)(1-(1-p)^, $ si nous supposons que la sensibilité et la spécificité sont de 100 %.

Le graphique à droite montre le nombre attendu de tests utilisant le tableau à deux dimensions, en supposant que $k=10$, en rouge avec le résultat en utilisant la méthode originale de Dorfman en bleu. Comme on peut le voir, le nombre de tests attendu est plus important en utilisant l'approche bidimensionnelle puisque nous investissons deux fois plus de tests dans la première série de tests. Cependant, chaque échantillon est inclus dans deux tests du premier tour. Pour qu'un échantillon infecté soit mal identifié, les deux tests devraient donner des résultats négatifs. Cela signifie que l'approche bidimensionnelle est souhaitable car la sensibilité de cette stratégie est supérieure à la sensibilité des tests individuels et nous réduisons encore le nombre de tests attendus lorsque la prévalence est faible.

Bien qu'il soit important de considérer l'impact que toute stratégie de mise en commun a sur ces mesures importantes, notre attention nous éloignera en grande partie des discussions sur la spécificité et la sensibilité. Consultez cette récente chronique sur les fonctionnalités pour une plongée en profondeur dans leur pertinence.

Limites théoriques

Il y a eu quelques travaux théoriques sur la gamme de valeurs de prévalence sur laquelle les stratégies de mise en commun sont avantageuses. Dans le langage de la théorie de l'information, on peut considérer une séquence de résultats de tests comme une source d'information ayant l'entropie $I(p) = -plog_2(p) - (1-p)log_2(1-p)$. Dans ce cadre, une stratégie de mutualisation peut être vue comme un encodage de la source pour compresser efficacement les informations générées.

Sobel et Groll ont montré que $E$, le nombre attendu de tests par personne, pour toute méthode de mise en commun efficace doit satisfaire $E geq I(p)$. Sur la droite est montré cette limite théorique en rouge ainsi que le nombre attendu de tests selon la méthode de Dorfman avec $k=10$.

D'autres travaux d'Ungar ont montré que lorsque la prévalence dépasse le seuil $pgeq (3-sqrt<5>)/2 approx 38\%$, alors nous ne pouvons pas trouver une stratégie de regroupement qui soit meilleure que de simplement tester tout le monde individuellement .

Tests RT-qPCR

Bien qu'il existe plusieurs tests différents pour le virus SARS-CoV-2, à l'heure actuelle, le test RT-qPCR est considéré comme le "gold standard". En plus de son intérêt intrinsèque, apprendre comment ce test fonctionne nous aidera à comprendre les stratégies de mise en commun. nous examinerons ensuite.

Un échantillon est prélevé sur un patient, souvent à l'aide d'un écouvillon nasal, et dispersé dans un milieu liquide. Le test commence par convertir les molécules d'ARN du virus en ADN complémentaire par un processus connu sous le nom de transcription inversée (RT). Une séquence de cycles d'amplification, appelée réaction quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) commence alors. Chaque cycle comprend trois étapes :

Le liquide est chauffé près de l'ébullition de sorte que l'ADN transcrit se dénature en deux brins séparés.

Ensuite, le liquide est refroidi de sorte qu'une amorce, qui a été ajoutée au liquide, se fixe à un brin d'ADN le long d'une séquence spécifique de 100 à 200 nucléotides. Cette séquence caractérise l'ADN complémentaire du virus SARS-CoV-2 et est suffisamment longue pour l'identifier de manière unique. Cela garantit que le test a une sensibilité élevée. Un marqueur fluorescent est attaché à l'amorce.

Dans une phase finale de réchauffement, des nucléotides supplémentaires se fixent à l'amorce pour compléter une copie de la molécule d'ADN complémentaire.

Le test RT-qPCR fait passer l'échantillon à travers 30 à 40 cycles d'amplification, ce qui entraîne une augmentation significative du nombre de molécules d'ADN, chacune étant dotée d'un marqueur fluorescent attaché. Après chaque cycle, nous pouvons mesurer la quantité de fluorescence et la traduire en une mesure du nombre de molécules d'ADN provenant du virus.

La fluorescence, car elle dépend du nombre de cycles, est indiquée ci-dessous. Un échantillon avec une charge virale relativement élevée montrera une fluorescence significative à un cycle précoce. Les courbes ci-dessous représentent différents échantillons et montrent comment la fluorescence mesurée croît au cours des cycles d'amplification. En se déplaçant vers la droite, chaque courbe est associée à une décroissance de la charge virale initiale de l'échantillon. Prises ensemble, ces courbes représentent une gamme d'une diminution d'un million de fois de la charge virale. En fait, le test est suffisamment sensible pour détecter à peine 10 particules virales dans un échantillon.

La FDA a établi un seuil, représenté par la ligne horizontale rouge, au-dessus duquel nous pouvons conclure que le virus SARS-CoV-2 est présent dans l'échantillon d'origine. Cependant, le test fournit plus qu'un résultat binaire positif/négatif en faisant correspondre la courbe de fluorescence d'un échantillon particulier aux courbes ci-dessus, nous pouvons déduire la charge virale présente dans l'échantillon d'origine. Le test fournit ainsi une mesure quantitative de la charge virale que nous utiliserons bientôt pour développer une méthode de pooling.

La mise en commun des échantillons de plusieurs individus, dont un seul est infecté, diluera l'échantillon infecté. L'effet est simplement que la réponse de fluorescence franchit le seuil FDA dans un cycle ultérieur. Il y a cependant une limite. Étant donné que le bruit peut se glisser dans les lectures de fluorescence autour du cycle 40, les normes de la FDA stipulent que seuls les résultats des 39 premiers cycles sont valides.

Études récentes de Bilder et Yelin et al a étudié les limites pratiques du regroupement d'échantillons dans le test RT-qPCR et a constaté qu'un seul échantillon infecté peut être détecté de manière fiable dans un pool de 32. (Une étude récente du CDC, cependant, soulève des inquiétudes quant à la détection du virus à l'aide du Test RT-qPCR après le 33e cycle d'amplification.)

Stratégies de test non adaptatives

La méthode de mise en commun de Dorfman et ses variantes décrites ci-dessus sont connues sous le nom de adaptatif méthodes car elles commencent par une première série de tests et utilisent ces résultats pour déterminer comment procéder avec une deuxième série. Étant donné que le test RT-qPCR nécessite 3 à 4 heures, la deuxième série de tests entraîne un retard dans l'obtention des résultats et immobilise les installations de test et le personnel. Une méthode non adaptative, qui produit des résultats pour un groupe d'individus en une seule série de tests, serait préférable.

Plusieurs méthodes non adaptatives ont été récemment proposées et sont encore utilisées aujourd'hui, telles que P-BEST. Les idées mathématiques qui sous-tendent ces diverses méthodes sont assez similaires. Nous allons nous concentrer sur celui qui s'appelle Tapestry.

Nous collectons d'abord des échantillons de $N$ individus et notons les charges virales de chaque échantillon par $x_j$. Nous formons ensuite ces échantillons en pools $T$ d'une manière qui sera expliquée un peu plus tard. Cela conduit à une matrice de regroupement $A_i^j$ où $A_i^j = 1$ si l'échantillon de l'individu $j$ est présent dans le $i^$ test et 0 sinon. La charge virale totale dans le $i^$ test est alors $ y_i = sum_ A_i^j x_j, $ qui peut être mesuré par le test RT-qPCR. En pratique, il y aura une certaine incertitude dans la mesure de $y_i$, mais cela peut être traité dans le cadre théorique que nous décrivons.

Nous avons maintenant un problème d'algèbre linéaire. Nous pouvons exprimer les équations $T$ qui résultent de chaque test sous la forme $ yvec = Axvec, $ où $yvec$ est le vecteur connu des résultats des tests, $A$ est la matrice de mise en commun $T imes N$, et $xvec$ est le vecteur inconnu des charges virales obtenues des patients.

Parce que $Tlt N$, il s'agit d'un système d'équations sous-déterminé, ce qui signifie que nous ne pouvons généralement pas nous attendre à résoudre pour le vecteur $xvec$. Cependant, nous avons quelques informations supplémentaires : parce que nous supposons que la prévalence $p$ est faible, le vecteur $xvec$ sera clairsemé, ce qui signifie que la plupart de ses entrées sont nulles. C'est le constat clé sur lequel reposent toutes les méthodes de mutualisation non adaptatives existantes.

Il s'avère que ce problème a été largement étudié dans le domaine de détection compressée, un ensemble de techniques de traitement du signal qui permettent de reconstruire un signal clairsemé à partir d'un petit nombre d'observations. Voici un aperçu de quelques idées importantes.

Tout d'abord, nous aurons l'occasion de considérer quelques mesures différentes de la taille d'un vecteur.

Premièrement, $ orm<0>$ est le nombre d'entrées différentes de zéro dans le vecteur $zvec$. Étant donné que la prévalence des échantillons positifs pour le SRAS-CoV-2 devrait être faible, nous recherchons une solution à l'équation $yvec=Axvec$ où $ orm<0>$ est faible.

La norme 1 est $ orm <1>= sum_j

et la 2-norme est la longueur euclidienne habituelle : $ orm <2>= sqrt $

Rappelez-vous qu'une isométrie est une transformation linéaire qui préserve la longueur des vecteurs. Avec la longueur euclidienne habituelle d'un vecteur $zvec$ écrit $||zvec||_2$, alors la matrice $M$ définit une isométrie si $||Mzvec||_2 = ||zvec|| _2$ pour tous les vecteurs $zvec$. Les colonnes d'une telle matrice forment un ensemble orthonormé.

Nous allons construire notre matrice de mise en commun $A$ pour qu'elle satisfasse un propriété d'isométrie restreinte (RIP), ce qui signifie essentiellement que de petits sous-ensembles des colonnes de $A$ sont presque orthonormés. Plus précisément, si $R$ est un sous-ensemble de $<1,2,ldots, N>$, on note $A^R$ la matrice formée en extrayant les colonnes de $A$ étiquetées par $R $ par exemple, $A^<<2,5>>$ est la matrice formée à partir des deuxième et cinquième colonnes de $A$. Pour un entier positif $S$, on définit une constante $delta_S$ telle que $ (1-delta_S)||xvec||_2 leq ||A^Rxvec||_2 leq (1+ delta_S)||xvec||_2 $ pour tout ensemble $R$ dont la cardinalité n'est pas supérieure à $S$. Si $delta_S = 0$, alors les matrices $A^R$ sont des isométries, ce qui impliquerait que les colonnes de $A^R$ sont orthonormées. Plus généralement, l'idée est que lorsque $delta_S$ est petit, alors les colonnes de $A^R$ sont proches d'être orthonormées.

Voyons comment nous pouvons utiliser ces constantes $delta_S$.

Parce que nous supposons que la prévalence $p$ est faible, nous savons que $xvec$, le vecteur des charges virales, est clairsemé. Nous allons montrer qu'une solution suffisamment creuse de $yvec = Axvec$ est unique.

Par exemple, supposons que $delta_ <2S>lt 1$, que $xvec_1$ et $xvec_2$ soient deux solutions clairsemées de l'équation $yvec = Axvec$, et que $ orm<0>, orm <0>leq S$. La dernière condition signifie que $xvec_1$ et $xvec_2$ sont clairsemés dans le sens où ils ont moins de $S$ de composants non nuls.

Il s'ensuit maintenant que $Axvec_1 = Axvec_2 = yvec$ de sorte que $A(xvec_1-xvec_2) = 0$. En effet, si $R$ est constitué des indices pour lesquels les composantes de $xvec_1-xvec_2$ sont non nulles, alors $A^R(xvec_1-xvec_2) = 0$.

Mais nous savons que la cardinalité de $R$ est égale à $ orm <0>leq 2S$, ce qui nous dit que $ 0 = ||A^R(xvec_1-xvec_2)|| _2 geq (1-delta_<2S>)||xvec_1-xvec_2||_2. $ Parce que $delta_<2S>lt 1$, nous savons que $xvec_1 - xvec = 0$ ou $xvec_1 = xvec_2$.

Par conséquent, si $delta_ <2S>lt 1$, toute solution de $yvec=Axvec$ avec $ orm <0>leq S$ est unique, c'est-à-dire que toute solution suffisamment clairsemée est unique.

Maintenant que nous avons vu une condition qui implique que les solutions éparses sont uniques, nous devons expliquer comment nous pouvons trouver des solutions éparses. Candès et Tao montrent, en supposant $delta_S + delta_ <2S>+ delta_ <3S>lt 1$, comment nous pouvons trouver une solution clairsemée à $yvec = Axvec$ avec $ orm <0>leq S$ en minimisant : $ min orm

yvec = Axvec. $ Il s'agit d'un problème d'optimisation convexe, et il existe des techniques standard pour trouver le minimum.

Pourquoi est-il raisonnable de penser que minimiser $ orm<1>$ conduira à une solution clairsemée ? Pensons visuellement au cas où $xvec$ est un vecteur à 2 dimensions. L'ensemble de tous les $xvec$ satisfaisant $ orm <1>= |x_1| + |x_2| leq C$ pour une constante $C$ est l'ensemble ombré ci-dessous :

Notez que les coins de cet ensemble tombent sur les axes de coordonnées où certains des composants sont nuls. Si nous considérons maintenant les solutions de $yvec=Axvec$, vues comme la ligne ci-dessous, nous voyons que les solutions où $ orm<1>$ est minimale tombent sur les axes de coordonnées. Cela force certains des composants de $xvec$ à être nuls et résulte en une solution clairsemée.

Cette technique est liée à celle appelée lasso (least absolute shrinkage and selection operator), which is well known in data science where it is used to eliminate unnecessary features from a data set.

All that remains is for us to find a pooling matrix $A$ that satisfies $delta_ + delta_ <2S>+ delta_ <3S>lt 1$ for some $S$ large enough to find vectors $xvec$ whose sparsity $ orm<0>$ is consistent with the expected prevalence. There are several ways to do this. Indeed, a matrix chosen at random will work with high probability, but the application to pooling SARS-CoV-2 samples that we have in mind leads us to ask that $A$ satisfy some additional properties.

The Tapestry method uses a pooling matrix $A$ formed from a Steiner triple system, an object studied in combinatorial design theory. For instance, one of Tapestry's pooling matrices is shown below, where red represents a 1 and white a 0.

This is a $16 imes40$ matrix, which means that we perform 16 tests on 40 individuals. Notice that each individual's sample appears in 3 tests. This is a relatively low number, which means that the viral load in a sample is not divided too much and that, in the laboratory, time spent pipetting the samples is minimzed. Each test consists of samples from about eight patients, well below the maximum of 32 needed for reliable RT-qPCR readings.

It is also important to note that two samples appear together in at most one test. Therefore, if $A^j$ is the $j^$ column of $A$, it follows that the dot product $A^jcdot A^k = 0$ or $1$. This means that two columns are either orthogonal or span an angle of $arccos(1/3) approx 70^circ$. If we scale $A$ by $1/sqrt<3>$, we therefore obtain a matrix whose columns are almost orthonormal and from which we can derive the required condition, $delta_S + delta_ <2S>+ delta_ <3S>lt 1$ for some sufficiently large value of $S$.

There is an additional simplification we can apply. For instance, if we have a sample $x_j$ that produces a negative result $y_i=0$ in at least one test in which it is included, then we can conclude that $x_j = 0$. This means that we can remove the component $x_j$ from the vector $xvec$ and the column $A^j$ from the matrix $A$. Removing all these sure negatives often leads to a dramatic simplication in the convex optimization problem.

Tapestry has created a variety of pooling matrices that can be deployed across a range of prevalences. For instance, a $45 imes 105$ pooling matrix, which means we perform 45 tests on 105 individuals, is appropriate when the prevalence is roughly 10%, a relatively high prevalence.

However, there is also a $93 imes 961$ pooling matrix that is appropriate for use when the prevalence is around 1%. Here we perform 93 tests on 961 patients in pools of size 32, which means we can test about 10 times the number of patients with a given number of tests. This is a dramatic improvement over performing single tests on individual samples.

If the prevalence turns out to be too high for the pooling matrix used, the Tapestry algorithm detects it and fails gracefully.

Along with non-adaptive methods comes an increase in the complexity of their implementation. This is especially concerning since reliability and speed are crucial. For this reason, the Tapestry team built an Android app that guides a laboratory technician though the pipetting process, receives the test results $y_i$, and solves for the resulting viral loads $x_j$ returning a list of positive samples.

Using both simulated and actual lab data, the authors of Tapestry studied the sensitivity and specificity of their algorithm and found that it performs well. They also compared the number of tests Tapestry performs with Dorfman's adaptive method and found that Tapestry requires many fewer tests, often several times fewer, in addition to finishing in a single round.

Sommaire

As we've seen here, non-adaptive pooling provides a significant opportunity to improve our testing capacity by increasing the number of samples we can test, decreasing the amount of time it takes to obtain results, and decreasing the costs of testing. These improvements can play an important role in a wider effort to test, trace, and isolate infected patients and hence control the spread of the coronavirus.

In addition, the FDA recently gave emergency use authorization for the use of these ideas. Not only is there a practical framework for deploying the Tapestry method, made possible by their Android app, it's now legal to do so.

Interestingly, the mathematics used here already existed before the COVID-19 pandemic. Dating back to Dorfman's original work of 1943, group pooling strategies have continued to evolve over the years. Indeed, the team of Shental et al. introduced P-BEST, their SARS-CoV-2 pooling strategy, as an extension of their earlier work to detect rare alleles associated to some diseases.

Merci

Mike Breen, recently of the AMS Public Awareness Office, oversaw the publication of the monthly Feature Column for many years. Mike retired in August 2020, and I'd like to thank him for his leadership, good judgment, and never-failing humor.

Les références

David Donoho. A Mathematical Data Scientist's perspective on Covid-19 Testing Scale-up. SIAM Mathematics of Data Science Distinguished Lecture Series. June 29, 2020.

Donoho's talk is a wonderful introduction to and overview of the problem, several approaches to it, and the workings of the scientific community.

This survey article provides a good overview of Dorfman's method and similar techniques.

Bilder was prolific in the area of group testing before (and after) the COVID-19 pandemic, and this page has many good resources, including this page of Shiny apps.

Milton Sobel and Phyllis A. Groll. Group testing to eliminate efficiently all defectives in a binomial sample. Bell System Technical Journal, Vol. 38, Issue 5, Sep 1959. Pages 1179&ndash1252.

Peter Ungar. The cutoff point for group testing. Communications on Pure and Applied Mathematics, Vol. 13, Issue 1, Feb 1960. Pages 49-54.

This paper and the next outline the Tapestry method.

This article and the next describe the P-BEST technique.

Noam Shental, Amnon Amir, and Or Zuk. Identification of rare alleles and their carriers using compressed se(que)nsing. Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 19.

David L. Donoho. Compressed Sensing. IEEE Transactions on Information Theory. Vol. 52, No. 4, April 2006.

Emamnuel J. Candès. Compressive sampling. Proceedings of the international congress of mathematicians. Vol. 2, 2006. Pages 1433-1452.

Emmanuel Candès, Justin Romberg, and Terence Tao. Stable Signal Recovery from Incomplete and Inaccurate Measurements. Communications in Pure and Applied Mathematics. Vol. 59, Issue 8, August 2006. Pages 1207-1223.

Emmanuel Candès and Terence Tao. Decoding by Linear Programming. IEEE Transactions on Information Theory. Vol. 51, Issue 12, Dec. 2005. Pages 4203-4215.

Chun Lam Chan, Pak Hou Che and Sidharth Jaggi. Non-adaptive probabilistic group testing with noisy measurements: Near-optimal bounds with efficient algorithms. 2011 49th Annual Allerton Conference on Communication, Control, and Computing (Allerton). Monticello, IL, 2011. Pages 1832-1839.

David Austin
Grand Valley State University
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4. DISCUSSION

The COVID-19 can present as symptomatic or symptomatic infections. Earlier it was thought that viral loads in symptomatic patients are higher compared with asymptomatic cases. However, in a recent study, it has been documented that viral loads are similar in symptomatic and asymptomatic patients thus, pool testing will produce similar results in all patients with COVID-19. 5 The present study is concordant with the findings of Abdalhamid et al 6 who reported that pool testing is effective in saving resources in the population having prevalence less than 10%. Laboratories have begun to demonstrate that SARS-CoV-2 can be detected in RT-qPCR performed on pooled samples, despite potential dilution. One limitation of pooling which authors feel is that positive sample reporting is delayed by a couple of hours which is taken in deconvoluting and retesting the specimen. They further concluded in his study of assessment of pooled testing to conserve resources that when the incidence rate of SARS-CoV-2 infection is 10% or less, group testing will result in the saving of reagents and personnel time with an overall increase in the testing capability of at least 69%.

A recent study from Lancet showed that over a range of pool sizes, from 4 to 30 samples per pool, Ct values of positive pools were between 22 and 29 for the envelope protein gene (E-gene) assay and between 21 and 29 for the spike protein gene (S-gene) assay. Ct values were lower in retested positive individual samples. The Ct values for both E-gene and S-gene assays in pools and individual positive samples were below 30 and easily categorized as positive. Ct value differences between pooled tests and individual positive samples (Ct pool − Ct positive sample) were in the range of up to five. 7 In another study on specimen pooling, it was observed that pooling did not affect the sensitivity of detecting SARS-CoV-2 when the PCR cycle threshold (Ct) of the original specimen was lower than 35. However, in specimens with low viral load (Ct > 35), 13.3% were false negative. 8 It can be explained by the fact that for each two-fold dilution Ct value increased by 1.24. 9 That means that all samples with Ct value greater than 38, when diluted to 1:5 and above, will show Ct value more than 40 and reported as negative on RT-PCR. Thus, in pooled samples, graphs should be analyzed for the sigmoid curve even beyond Ct value 40 and in case of the appearance of any graph, the RT-PCR should be repeated with deconvoluted samples. Further unpublished data from our center suggest that less than 37 and by following the above-mentioned precautions we picked maximum possible positive cases. Similar cases have been reported by another recent study. dix

To understand the advantages of a pooling approach, consider a laboratory receiving N = 100 samples and prevalence is 5%, that is, 5/100 samples are positive. If 10 pools are created for 100 samples then as a best-case scenario, we can have one pool positive and nine pool negative, and the total PCR reagent used to test 100 samples is 20. In the worst-case scenario, five pools will be positive thus total consumable used will be 60. So, taking the mean value as 40, we propose that for 100 samples in pooled testing we require 40 test reagents, thus saving 60% reagents. Each negative result, obtained by a single RT-qPCR reaction, determines that 100 individual samples are negative without the need for individual testing.


Reaction- and sample-specific inhibition affect standardization of qPCR assays of soil bacterial communities

Quantitative PCR (qPCR) is a popular technique used to quantify target sequences from DNA isolated from soil, but PCR inhibition makes it difficult to estimate gene copy number. Here, we evaluated the extent to which inhibition associated with reaction conditions and sample-specific properties influence the linear range of amplification, and the efficiency and sensitivity of qPCR assays of three bacterial gene targets. We adopted a sample pool approach and exploited the mathematical basis of qPCR to correct for sample-specific effects on amplification. Results revealed that qPCR efficiency and sensitivity were dependent on all conditions tested. In addition, the effect of annealing temperature and SYBR green PCR kit was target-specific, suggesting that the sample pool approach is appropriate for evaluating the quality of new primers. Likewise, the efficiency and sensitivity of qPCR amplification was sample-specific and is likely a result of site and date-specific co-extractants. When relativized against calculations based on plasmid curves alone, reaction-specific and sample-specific inhibition influenced calculations of gene copy number. To account for these differences, we present a brief protocol for soil samples that will facilitate comparison of future datasets.

Highlights

► We compare reaction- and sample-specific inhibition of qPCR amplification of soil DNA. ► Sample-specific properties affect quantification of soil bacterial communities. ► Reaction-specific amplification affects quantification of soil bacterial communities. ► Data on qPCR amplification of samples can be used to standardize these differences.


Conclusion

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Pooling for qPCR - Biology

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Les articles du Choix de l'éditeur sont basés sur les recommandations des éditeurs scientifiques des revues MDPI du monde entier. Les rédacteurs en chef sélectionnent un petit nombre d'articles récemment publiés dans la revue qui, selon eux, seront particulièrement intéressants pour les auteurs ou importants dans ce domaine. L'objectif est de fournir un aperçu de certains des travaux les plus passionnants publiés dans les différents domaines de recherche de la revue.


PCR output applications

PCR has become an indispensable tool in modern molecular biology and has completely transformed scientific research. The technique has also opened up the investigation of cellular and molecular processes to those outside the field of molecular biology and consequently also finds utility by scientists in many disciplines.

Whilst PCR is itself a powerful standalone technique, it has also been incorporated into wider techniques, such as cloning and sequencing, as one small but important part of these workflows.

Research applications of PCR include:


Gene transcription - PCR can examine variations in gene transcription among cell types, tissues and organisms at a specific time point. In this process, RNA is isolated from samples of interest, and reverse-transcribed into cDNA. The original levels of RNA for a specific gene can then be quantified from the amount of cDNA amplified in PCR.

Génotypage - PCR can detect sequence variations in alleles of specific cells or organisms. A common example is the genotyping of transgenic organisms, such as knock-out and knock-in mice. In this application, primers are designed to amplify either a transgene portion (in a transgenic animal) or the mutation (in a mutant animal).

Cloning and mutagenesis - PCR cloning is a widely used technique where double-stranded DNA fragments amplified by PCR are inserted into vectors (e.g., gDNA, cDNA, plasmid DNA). This for example, enables the creation of bacterial strains from which genetic material has been deleted or inserted. Site-directed mutagenesis can also be used to introduce point mutations via cloning. This often employs a technique known as recombinant PCR , in which overlapping primers are specifically designed to incorporate base substitutions (Figure 4). This technique can also be used to create novel gene fusions.


Genetic research - PCR is used in most laboratories worldwide. One of the most common applications is gene transcription analysis 9 , aimed at evaluating the presence or abundance of particular gene transcripts. It is a powerful technique in manipulating the genetic sequence of organisms – animal, plant and microbe - through cloning. This enables genes or sections of genes to be inserted, deleted or mutated to engineer in genetic markers alter phenotypes, elucidate gene functions and develop vaccines to name but a few. In genotyping, PCR can be used to detect sequence variations in alleles in specific cells or organisms. Its use isn’t restricted to humans either. Genotyping plants in agriculture assists plant breeders in selecting, refining, and improving their breeding stock. PCR is also the first step to enrich sequencing samples, as discussed above. Par exemple, la plupart des techniques de cartographie du Human Genome Project (HGP) reposaient sur la PCR.

Medicine and biomedical research - PCR is used in a host of medical applications, from diagnostic testing for disease-associated genetic mutations, to the identification of infectious agents. Another great example of PCR use in the medical realm is prenatal genetic testing. Prenatal genetic testing through PCR can identify chromosome abnormalities and genetic mutations in the fetus, giving parents-to-be important information about whether their baby has certain genetic disorders. PCR can also be used as a preimplantation genetic diagnosis tool to screen embryos for in vitro fertilization (IVF) procedures.

Forensic science - Our unique genetic fingerprints mean that PCR can be instrumental in both paternity testing and forensic investigations to pinpoint samples' sources. Small DNA samples isolated from a crime scene can be compared with a DNA database or with suspects' DNA, for example. These procedures have really changed the way police investigations are carried out. Authenticity testing also makes use of PCR genetic markers, for example, to determine the species from which meat is derived. Molecular archaeology too utilizes PCR to amplify DNA from archaeological remains.

Environmental microbiology and food safety - Detection of pathogens by PCR, not only in patients' samples but also in matrices like food or water, can be vital in diagnosing and preventing infectious disease.

PCR is the benchmark technology for detecting nucleic acids in every area, from biomedical research to forensic applications. Kary Mullis's idea, written on the back of a receipt on the side of the road, turned out to be a revolutionary one.

Les références

1. Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 1976127(3):1550-57 doi: 10.1128/JB.127.3.1550-1557.1976

2. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985230(4732):1350 doi: 10.1126/science.2999980

3. Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HRH. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics 20055(2):209-19 doi: 10.1586/14737159.5.2.209

4. Bachman J. Chapter Two - Reverse-Transcription PCR (RT-PCR). In: Lorsch J, ed. Methods in Enzymology: Academic Press, 2013:67-74. doi : 10.1016/B978-0-12-420037-1.00002-6

5. Morley AA. Digital PCR: A brief history. Biomol Detect Quantif 20141(1):1-2 doi: 10.1016/j.bdq.2014.06.001

6. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports 20177(1):2409 doi: 10.1038/s41598-017-02217-x

7. Ahrberg CD, Manz A, Chung BG. Polymerase chain reaction in microfluidic devices. Lab on a Chip 201616(20):3866-84 doi: 10.1039/C6LC00984K

8. Garibyan L, Avashia N. Polymerase chain reaction. J Invest Dermatol 2013133(3):1-4 doi: 10.1038/jid.2013.1

9. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques 200844(5):619-26 doi: 10.2144/000112776


Voir la vidéo: 33min result, New qPCR Detective Solution for DNARNA Release (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Ten Eych

    Idée très drôle

  2. Rowley

    Désolé...

  3. Beldane

    Il me semble que cela a déjà été discuté.

  4. Kyron

    Un sujet incomparable, je suis très intéressé)))))

  5. Barnet

    Je pense que vous accepterez l'erreur. Je peux le prouver. Ecrivez moi en MP, on discutera.



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