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La multiplication des fragments d'ADN


Avec la fragmentation des molécules d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction et leur reconnaissance par électrophorèse sur gel, l'étape suivante consiste à multiplier (cloner) le fragment obtenu et à les soumettre à la technologie de l'ADN recombinant.

La technique de la multiplication des brins d'ADN est appelée PCR (réaction en chaîne par polymérase).

Dans les années 1980, la technique de la PCR a été utilisée pour faire des milliers de copies d'un seul morceau d'ADN. Cette technique est utilisée dans des tubes à essai contenant de l'ADN et certains autres composés nécessaires, tels que amorces (ADN amorces) et Enzyme ADN polymérase (enzyme qui fait la réplication de l'ADN).

Le amorces ce sont des brins d'ADN, avec environ 20 bases (A, T, C, G) complémentaires, c'est-à-dire qu'ils se lient par complémentarité au début de la séquence d'ADN à multiplier. Lorsqu'une molécule d'ADN doit être multipliée, le double brin doit être séparé, formant ainsi deux brins différents mais complémentaires. Chaque bande servira de modèle pour la duplication, nous avons donc besoin de deux types différents d'amorces (voir figure)

Technique de PCR, étape par étape

Un échantillon d'ADN minimal est obtenu à partir d'une cellule humaine.

  1. L'échantillon d'ADN, l'enzyme de réplication (ADN polymérase), les nucléotides d'ADN et les amorces complémentaires de séquence d'ADN sont placés dans un tube à essai.
  2. Le tube à essai est placé dans une machine de PCR (une machine qui élève et abaisse la température selon un programme). Les étapes de chauffage et de refroidissement suivantes ont lieu à l'intérieur de la machine contrôlée par le programme.
  3. Le tube est chauffé à 94 ° C pour dénaturer (séparer le double brin) l'ADN.

4. Chaque brin unique d'ADN dénaturé sert de modèle pour la synthèse de nouveaux brins complémentaires. Pour cela, il est refroidi à 54 ° C où les amorces sonnent au début des deux bandes simples, servant d'amorces pour l'enzyme polymérase.

5. Le tube est réchauffé à 72 ° C (température de fonctionnement idéale de l'ADN polymérase) pour la duplication de la bandelette. L'ADN polymérase commence, après la fin de l'amorce, à placer les nucléotides libres sur le brin d'ADN en les liant ensemble, formant ainsi un nouveau double brin.