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Comment concevoir des amorces internes ?

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J'ai des séquences de la Cytochrome c oxydase I (COI) de plusieurs populations de Peringia ulvae (Mollusca; Gastropoda; Littorinimorpha; Hydrobiidae). J'ai besoin de séquences COI supplémentaires d'une population spécifique. En utilisant les mêmes amorces et protocole PCR que pour les autres populations, je n'obtiens aucun produit PCR pour la population spécifique. Mon PI m'a suggéré de concevoir des amorces COI internes pour Peringia ulvae. Comment puis je faire ça? Dois-je utiliser les séquences COI des autres populations ?


Si vous n'obtenez pas d'amplification, il y a plusieurs choses à visiter avant de vouloir concevoir des amorces internes. Vous devriez essayer de dépanner vos réactions PCR avant de concevoir et de commander des amorces internes. Si vous faites mal les PCR, il est probable que vous rencontrerez à nouveau les mêmes problèmes avec les amorces internes.

Il existe d'excellents guides pour le dépannage des PCR - Une simple recherche sur Google "Dépannage des PCR" devrait vous donner beaucoup de matériel à parcourir. Celui-ci provient de NEB, mais il en existe plusieurs autres, chaque fabricant ayant le sien, vous pouvez donc vous référer à l'un des réactifs que vous utilisez.

Les amorces donnent généralement de bonnes lectures à partir de l'extrémité 5' pour environ 600-700 pb et après cela, la qualité de l'appel de base se détériore, donc si votre amplicon cible est au-dessus de 1500 pb environ, vous auriez besoin d'amorces internes car les amorces « externes » donneraient vous de bonnes séquences pour seulement 1400 pb environ (600-700 pb dans les deux sens, pour les amorces avant et rev). Ainsi, des amorces internes peuvent être utilisées pour séquencer les régions qui ne peuvent pas être atteintes par les amorces directes et inverses principales (externes). Les articles publiés à partir desquels vous utilisez les amorces externes auront très probablement les amorces internes si CO1 est suffisamment long pour nécessiter des amorces internes.

Sinon, vous devrez aligner les séquences existantes des autres populations et examiner les régions de l'alignement conservées qui pourraient servir de sites d'amorçage potentiels. Il y a d'autres problèmes à régler avant de pouvoir considérer une «région conservée» comme un «site d'amorçage» et de commander des amorces. Encore une fois, il existe d'excellents didacticiels de conception d'amorces disponibles, il suffit d'une recherche sur Google.

Faites-moi savoir si certaines parties de la réponse ne sont pas claires ou ressemblent à du jargon et je ferai de mon mieux pour la simplifier pour vous. Cependant, je suggérerais fortement de dépanner d'abord le PCR - par exemple. essayer une PCR en gradient pour trouver la température de recuit optimale.


Conception d'amorces de séquençage PCR et Sanger - Seq It Out #5

La conception d'amorce est comme l'art. Il existe plusieurs modèles pour couvrir la région d'intérêt. Êtes-vous un artiste"?

Les amorces sont cruciales pour le succès de l'amplification de la cible et du séquençage ultérieur dans les flux de travail de séquençage PCR et Sanger.

Jetons un coup d'œil à notre livre de laboratoire :

Dans le flux de travail de séquençage Sanger typique à partir de l'ADN génomique, il faut d'abord amplifier la cible par PCR, puis exécuter la réaction de séquençage Sanger. Si vous partez d'ADN plasmidique purifié, il suffit d'exécuter la réaction de séquençage de Sanger. L'amplification par PCR nécessite 2 amorces de brins opposés qui déterminent la région de séquence amplifiée dans le sens direct et inverse.

Le séquençage de Sanger diffère de la PCR en ce qu'une seule amorce est utilisée dans la réaction. Typiquement, pour un fragment PCR donné, deux réactions de séquençage de Sanger sont mises en place, l'une pour le séquençage du brin direct, l'autre pour le séquençage du brin inverse. La conception des amorces est un aspect important lié à de nombreuses formes de PCR, notamment la PCR de base, l'analyse de fragments, l'analyse quantitative et le séquençage de Sanger.

Voici quelques points à garder à l'esprit lors de la conception de vos propres amorces.

  1. La longueur de l'amorce doit être comprise entre 18 et 22 bases.
  2. L'apprêt doit avoir une teneur en GC de 50 à 55 %.
  3. Les amorces doivent avoir un verrou GC à l'extrémité 3'.
  4. La température de fusion de tout bon apprêt doit être comprise entre 50 °C et 55 °C.
  5. L'amorce ne doit pas inclure de régions de base poly.
  6. Quatre bases ou plus qui complètent l'une ou l'autre direction de l'apprêt doivent être évitées.

De plus, il existe des directives spécifiques à la PCR pour vous aider à concevoir de bonnes amorces PCR. Ces directives peuvent être consultées sur notre site Web.

Depuis la conception de l'amorce n'est pas facile. Il existe un risque de concevoir les mauvaises amorces qui pourraient être coûteuses dans vos expériences. Vous vous demandez peut-être : existe-t-il un moyen plus simple ? La réponse est oui, et Thermo Fisher Scientific propose un outil gratuit pour vous aider. L'outil Primer Designer est un outil de recherche en ligne d'amorces PCR/Sanger gratuit qui comprend plus de 600 000 paires d'amorces couvrant l'exome humain et le génome mitochondrial humain. Vous pouvez choisir la plage de longueur d'amplicon pour votre échantillon et votre intérêt de recherche pour l'optimiser pour votre expérience.

Si vous effectuez une confirmation NGS avec votre analyseur génétique d'électrophorèse capillaire, cet outil peut vraiment simplifier votre flux de travail. Vous pouvez l'utiliser en ligne en téléchargeant votre fichier .vcf, ou si vous avez un séquenceur Ion Torrent, c'est encore mieux, car il y a une intégration transparente avec votre logiciel ion reporter pour télécharger vos données dans cet outil Primer Designer. Vous pouvez désormais trouver les bons apprêts en quelques clics.

J'espère que cette vidéo a été utile sur la conception de l'amorce, et je suis sûr que vous aurez d'autres questions.


Outil de conception Primer3

Primer3 est le logiciel open source utilisé pour la conception d'amorces. Il est intégré à divers progiciels et services Web.

Primer3 peut effectuer plusieurs types de tâches de conception et vérifier l'exactitude des paires d'amorces existantes.

Primer3 choisit des amorces en fonction de :

  1. température de fusion (Tm), teneur en GC, possibilités amorces-dimères
  2. taille du produit PCR
  3. contraintes de position dans la matrice d'ADN, et ainsi de suite.

Primer3 peut également concevoir des sondes d'hybridation et des amorces de séquençage.

Les composants de Primer3 sont les deux interfaces Web, Primer3web (l'interface Web d'origine) et Primer3Plus (une interface orientée tâche plus facile à utiliser) et le programme de conception d'amorces en ligne de commande, primer3_core.

Primer3_core peut être intégré à d'autres logiciels et utile aux bioinformaticiens.

La plus récente primer3_core version est disponible sur le site sourceforge.

  • Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, et al. Primer3—nouvelles capacités et interfaces. Recherche sur les acides nucléiques. 201240(15):e115. doi: 10.1093/nar/gks596.
  • Untergasser A, Nijveen H, Rao X, Bisseling T, Geurts R, Leunissen JAM. Primer3Plus, une interface Web améliorée pour Primer3. Recherche sur les acides nucléiques. 200735 (problème de serveur Web) : W71-W74. doi: 10.1093/nar/gkm306.

Comment concevoir des amorces RT-PCR in-frame pour vecteur d'expression ? - (mars/05/2012 )

J'ai quelques jeux d'amorces d'un papier, pour l'amplification PCR de l'ADNc. Je souhaite utiliser ces amorces pour la ligature dans un vecteur d'expression pour une expression éventuelle. Si l'article mentionne que ces amorces pourraient être utilisées pour créer un produit PCR pour l'expression, cela signifie-t-il qu'elles sont déjà conçues pour être « dans le cadre de lecture » ? J'ai modifié ces amorces pour inclure des sites de restriction. Comment puis-je déterminer si mes amorces s'amplifieront dans le cadre de lecture correct pour une expression éventuelle ?

La seule chose dont vous avez besoin pour l'expression dans le cadre est d'avoir le codon de démarrage ATG en place. Si vous fabriquez des amorces pour produire une protéine de pleine longueur, le moyen le plus simple de s'assurer qu'elles sont dans le cadre est d'inclure l'ATG et les 15 à 18 premières bases restantes de la séquence. L'amorce inverse doit être le complément inverse des 20 dernières bases de la séquence.

Vous n'avez pas à vous soucier des bases avant l'ATG (bien que vous puissiez ajouter une séquence kozak pour améliorer la transcription), car le promoteur s'occupe de la liaison des facteurs de transcription.


Concevoir des amorces avec l'assistant d'amorce

Nous soutenons la conception d'amorces PCR, qPCR et de séquençage. Choisissez le type d'amorce que vous voulez dans la liste déroulante Tâche.

Suivez chaque étape de l'assistant pour définir vos paramètres :

Apprêt: Spécifiez les paramètres d'amorce min, max et optimal.

Amplicon : Spécifiez la taille min/max de l'amplicon.

Génération des résultats : Spécifiez le nombre de résultats d'amorces possibles

Conception partielle : Définir une partie de la séquence incluse dans l'amorce si vous le souhaitez.

Conception à travers les jonctions : Concevez des amorces à travers les jonctions si vous le souhaitez.

Emplacement de la force : Spécifiez l'emplacement de l'amorce.

Remarque : La plage de longueurs d'amplicon par défaut est de 200 à 1 000 pb. Si la longueur de votre amplicon est en dehors de cette plage, veuillez ajuster les valeurs par défaut. Si la longueur de votre amplicon ne correspond pas à la plage sélectionnée, Benchling indiquera qu'"aucune amorce n'a pu être trouvée".

Astuce de pro : le moyen le plus simple de choisir votre région cible est de la sélectionner sur votre séquence et de cliquer sur Utiliser la sélection.

Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur Générer des amorces. Choisissez votre paire amorce/amorce qui vous intéresse et cliquez sur Enregistrer les amorces sélectionnées.


Stratégie PCR

De nombreux vecteurs d'expression contiennent un sous-officier je (CCATGG) à l'extrémité 5' du site de clonage multiple. Les ATG au sein de ce site peut être utilisé directement pour créer le codon d'initiation ATG et/ou le codon ATG pour le résidu méthionine N-terminal. Les gènes cibles ou les produits PCR qui contiennent soit des sites Nco I soit des sites qui génèrent des surplombs compatibles à leurs extrémités 5' peuvent être clonés dans ces sites Nco I (voir tableau ci-dessous).

Enzyme site de restriction
Afl III A C Pu Py G T
BspH I T C A T G A
Btg je C C Pu Py G G
sous-officier je C C A T G G
PCI I A C A T G T
Sty je C C A/T A/T G G

D'habitude sous-officier je seront utilisées, mais les autres enzymes énumérées sont des alternatives utiles au cas où le gène cible contient des sites Nco I internes. Cependant, chacun de ces sites de restriction dicte ce que doit être le premier nucléotide du prochain codon triplet, ce qui peut empêcher la génération de protéine cible native. Un stratégie alternative est de créer les bons surplombs 5' en utilisant des enzymes de restriction qui se clivent en aval de leur site de reconnaissance (voir la figure ci-dessous).

Ces sites de restriction peuvent être transformés en amorces PCR de telle sorte que des surplombs compatibles Nco I puissent être générés. Ici, nous montrons un exemple d'une amorce PCR qui code un Bsa je site ( rouge ) pour la génération d'un porte-à-faux compatible Nco I ( bleu ) :


3.5 Mutagenèse dirigée par site Quickchange

Dans cette section, vous découvrirez la mutagenèse dirigée Quickchange et en quoi elle diffère de la mutagenèse PCR conventionnelle. Tout d'abord, la mutagenèse dirigée Quickchange ne nécessite PAS de digestion avec une endonucléase de restriction conventionnelle ou de ligature, réduisant ainsi le temps requis pour la mutagenèse d'une semaine à quelques jours. Quickchange a plusieurs restrictions. (1) Seuls quelques nucléotides peuvent être modifiés à la fois. Cela indique qu'il ne peut pas être utilisé pour amplifier une séquence d'ADN du génome. (2) Quickchange fournit une amplification moins importante de la séquence d'ADN cible que la PCR conventionnelle. Par conséquent, des précautions supplémentaires doivent être prises pour s'assurer qu'une quantité significative d'ADN muté est produite.

Passons en revue les étapes de la mutagenèse Quickchange (Fig 3.4)

Figure 3.4 : Schémas de la mutagenèse Quickchange.

Étape 1: Les amorces de Quickchange atterrissent au même endroit dans le vecteur de clonage. L'un se lie au haut, l'autre au brin inférieur de l'ADN double brin. Puisque la polymérase réplique le plasmide entier à partir du site de mutation, la séquence d'ADN cible doit déjà être insérée dans un vecteur de clonage (nécessite un ADN circulaire). Cette méthode ne peut pas être utilisée pour modifier la séquence d'ADN sur le chromosome.

Étape 2: L'amplification par PCR produit de nombreuses copies du brin d'ADN supérieur et inférieur du vecteur de clonage contenant l'ADN muté. La mutagenèse à changement rapide synthétise donc de nombreuses copies de la plasmide entier pas seulement l'ADN d'intérêt. Notez que l'ADN synthétisé est entaillé (pas un cercle complet), cela signifie qu'il ne peut pas servir de modèle pour d'autres cycles de PCR entraînant une amplification moins significative de la séquence cible. Par conséquent, l'élimination de l'ADN matrice est nécessaire (étape 3) pour s'assurer qu'un nombre important de cellules qui abritent l'ADN muté sont produites à l'étape 4.

Étape 3: Après amplification par PCR, le mélange réactionnel est traité avec une endonucléase de restriction unique DpnI. DpnI digère le plasmide modèle (celui qui ne contient pas de mutations) ne laissant que des vecteurs de clonage contenant vos mutants. L'enzyme DpnI accomplit cette tâche en digérant tout acide nucléique avec une base d'adénosine méthylée. Les acides nucléiques générés par PCR n'ont pas de bases méthylées, ils sont donc laissés intacts par DpnI. Aucune purification, traitement à la phosphatase ou ligature n'est nécessaire après le traitement DpnI, réduisant ainsi le temps et le réactif nécessaires à la mutagenèse.

Étape 4: Le vecteur de clonage muté est placé dans E. coli bactéries pour d'autres études (transformation).

Un aperçu de chaque étape est affiché Figure 3.4.

Une comparaison de Quickchange et de la PCR conventionnelle est présentée dans le tableau ci-dessous :

Conventionnel Changement rapide
Amorces Complémentaire au début et à la fin de la séquence souhaitée Les amorces atterrissent au même endroit sur le vecteur de clonage
Amplification Amplifie l'ADN entre les amorces Amplifie tout le plasmide
But Mutagenèse dirigée, amplification de l'ADN souhaité à partir du génome Mutagenèse dirigée : ne modifie que quelques nucléotides
Temps 4-5 jours 1-2 jours
Caveat Lent, la conception de l'amorce est plus complexe Seul l'ADN matrice sert de matrice, il est donc nécessaire à une concentration plus élevée et doit être retiré avant d'insérer l'ADN dans les cellules


Mutagenèse dirigée sur site

La mutagenèse dirigée (SDM) est une méthode pour créer des changements spécifiques et ciblés dans l'ADN plasmidique double brin. Il existe de nombreuses raisons d'apporter des modifications spécifiques à l'ADN (insertions, suppressions et substitutions), notamment :

  • Étudier les changements dans l'activité des protéines qui se produisent à la suite de la manipulation de l'ADN.
  • Pour sélectionner ou cribler des mutations (au niveau de l'ADN, de l'ARN ou de la protéine) qui ont une propriété souhaitée
  • Pour introduire ou supprimer des sites ou des marqueurs d'endonucléases de restriction


Présentation de la méthode :

SDM est un in vitro procédure qui utilise des amorces oligonucléotidiques conçues sur mesure pour conférer une mutation souhaitée dans un plasmide d'ADN double brin. Auparavant, une méthode mise au point par Kunkel (Kunkel, 1985) qui tire parti d'une souche déficiente en dUTPase et en uracile déglycosylase afin que le receveur E. coli dégrade l'ADN de type sauvage contenant de l'uracile a été largement utilisé. Actuellement, il existe un certain nombre de kits disponibles dans le commerce qui nécessitent également une modification spécifique et/ou unique E. coli (par exemple, le Phusion Site-Directed Mutagenesis ® de Thermo et le système GeneArt ® de Life). Les méthodes les plus utilisées ne nécessitent aucune modification ni souche unique et incorporent des mutations dans le plasmide par PCR inverse avec des amorces standards. Pour ces méthodes, les amorces peuvent être conçues dans un chevauchement (QuikChange & reg, Agilent) ou une orientation dos à dos (Q5 & reg Kit de mutagenèse dirigée vers le site) (Figure 1). Le chevauchement de la conception des amorces donne un produit qui se recircularise pour former un plasmide à double entaille. Malgré la présence de ces entailles, ce produit circulaire peut être directement transformé en E. coli, bien qu'avec une efficacité inférieure à celle des plasmides non coupés. Les méthodes de conception d'amorces dos à dos ont non seulement l'avantage de transformer des plasmides non coupés, mais permettent également une amplification exponentielle pour générer beaucoup plus du produit souhaité (figure 2). De plus, comme les amorces ne se chevauchent pas, les tailles de délétions ne sont limitées que par le plasmide et les insertions ne sont limitées que par les contraintes de la synthèse d'amorces moderne. Actuellement, en divisant l'insertion entre les deux amorces, des insertions jusqu'à 100 pb peuvent être créées en routine en une seule étape en utilisant cette méthode.

Avant que les amorces ne soient conçues, il est important de déterminer quel flux de mutagenèse doit être utilisé. Nous présentons ici une comparaison de trois kits disponibles dans le commerce (Figure 3) et une brève description des caractéristiques importantes.

Avant de planifier votre prochaine expérience SDM, assurez-vous de lire notre liste de considérations expérimentales importantes.

Figure 1 : La mutagenèse spécifique au site se déroule en moins de 2 heures

L'utilisation d'un mélange maître, d'un mélange d'enzymes KLD multi-enzymes unique et d'une polymérase rapide garantit que, pour la plupart des plasmides, la réaction de mutagenèse est terminée en moins de deux heures.

Figure 2 : Présentation du kit de mutagenèse dirigée Q5

Ce kit est conçu pour une incorporation rapide et efficace d'insertions, de délétions et de substitutions dans l'ADN plasmidique double brin. La première étape est une amplification exponentielle à l'aide d'amorces standard et d'une formulation de master mix d'ADN polymérase haute fidélité Q5 Hot Start. La deuxième étape implique l'incubation avec un mélange d'enzymes unique contenant une kinase, une ligase et DpnI. Ensemble, ces enzymes permettent une circularisation rapide du produit PCR et l'élimination de l'ADN matrice. La dernière étape est une transformation à haute efficacité en cellules chimiquement compétentes (fournies).

Figure 3 : Conception d'amorce pour le kit de mutagenèse dirigée Q5

Les substitutions, délétions et insertions sont incorporées dans l'ADN plasmidique grâce à l'utilisation d'amorces sens (noir) et inverse (rouge) spécialement conçues. Contrairement aux kits qui reposent sur l'amplification linéaire, les amorces conçues pour le kit de mutagenèse dirigée Q5 ne doivent pas se chevaucher pour garantir que les avantages de l'amplification exponentielle sont réalisés. A) Les substitutions sont créées en incorporant le(s) changement(s) nucléotidique(s) souhaité(s) (indiqués par *) au centre de l'amorce directe, y compris au moins 10 nucléotides complémentaires du côté 3´ de la ou des mutations. L'amorce inverse est conçue de sorte que les extrémités 5´ des deux amorces s'hybrident dos à dos. B) Les suppressions sont conçues en concevant des amorces directes et inverses standard non mutagènes qui flanquent la région à supprimer. C) Des insertions inférieures ou égales à 6 nucléotides sont incorporées à l'extrémité 5´ de l'amorce directe tandis que l'amorce inverse s'hybride dos à dos avec l'extrémité 5´ de la région complémentaire de l'amorce directe. D) Des insertions plus grandes peuvent être créées en incorporant la moitié de l'insertion souhaitée dans les extrémités 5´ des deux amorces. La taille maximale de l'insertion est largement dictée par les limitations de la synthèse des oligonucléotides.

Mutagenèse dirigée et considérations expérimentales mdash

L'élément le plus critique pour le succès d'une expérience SDM est la conception appropriée de l'amorce. Comme mentionné ci-dessus, la première considération lors de la conception des amorces est l'emplacement des deux amorces l'une par rapport à l'autre. Les amorces conçues dos à dos ont l'avantage d'une amplification exponentielle. Cependant, les erreurs de polymérase pendant la PCR seront également propagées de manière exponentielle, par conséquent, seules les enzymes les plus fidèles doivent être utilisées.

Un autre aspect important à considérer lors de la conception des apprêts est la température de fusion. Les amorces directe et inverse doivent être conçues avec des températures de fusion similaires afin que chaque amorce se recuit avec une efficacité comparable. Les calculs de température de fusion peuvent être difficiles pour SDM, car la plupart des outils en ligne ne tiennent pas compte des modifications des températures de recuit dues à des nucléotides incompatibles.

En revanche, NEBaseChanger, un outil de conception d'amorces en ligne gratuit, a été développé non seulement pour aider à la conception d'amorces pour le kit de mutagenèse dirigée Q5, mais également pour fournir une température de recuit pour Q5 qui tient compte des nucléotides incompatibles.

Modification de l'amorce :

Pour certains flux de travail, les amorces doivent être synthétisées avec un phosphate 5-prime pour permettre une réaction de ligature intramoléculaire en aval (ceci n'est pas requis pour le kit de mutagenèse dirigée Q5.

Pureté de l'apprêt :

Une considération supplémentaire est la pureté des amorces. Une synthèse d'amorce incomplète peut entraîner des erreurs au niveau du site de mutagenèse. Comme les erreurs de synthèse se produisent plus souvent avec des amorces plus grandes, il est recommandé d'avoir des amorces d'une longueur supérieure à 40-50 nucléotides, purifiées par PAGE.

Suppression du modèle:

Pour la plupart des expériences SDM, la matrice PCR non mutée est retirée du pool de produits PCR à l'aide de l'endonucléase de restriction DpnI. DpnI digère sélectivement l'ADN méthylé (c'est-à-dire les plasmides propagés et isolés de E. coli). Parce que les produits PCR sont générés in vitro, ils ne contiennent pas de groupes méthyle et sont résistants à l'activité DpnI.

La conception d'amorces dos à dos donne un produit PCR linéaire double brin. Avant transformation, ce produit est circularisé à l'aide d'une réaction de ligature intramoléculaire. Etant donné les conditions de tampon appropriées, cette réaction de phosphorylation et de ligature peut être accomplie en aussi peu que cinq minutes à température ambiante.

Transformation:

Les produits de SDM peuvent être transformés en produits chimiquement les plus compétents E. coli souches adaptées au clonage. L'efficacité de la transformation variera en fonction de la taille du plasmide ainsi que de la qualité et de l'efficacité des cellules compétentes. L'électroporation est possible si la teneur en sel de la solution de plasmide est éliminée par dialyse ou échange de tampon. Pour les protocoles qui incluent la transformation de plasmides non ligaturés, les efficacités de transformation sont diminuées.

Évaluation du produit :

Afin d'assurer le succès de la réaction SDM, le plasmide final doit être isolé à partir d'un seul E. coli clone et le site de mutation doivent être séquencés dans les deux sens. Tant que la fidélité de la polymérase utilisée est suffisante, il n'est généralement pas nécessaire de séquencer la totalité du plasmide.


Règles de conception et de mise en page des thèses de doctorat

Les quatrième de couverture de la thèse est d'avoir :

  1. un sceau complet de l'Université en bas à gauche,
  2. un bloc d'adresse en bas à droite
  3. une liste des articles inclus dans la thèse.

Si vous avez des questions concernant le profil graphique, veuillez les adresser aux responsables du profil graphique de l'Université de Lund ou, s'il s'agit de questions plus générales sur la conception de la thèse, à Media-Tryck, l'imprimeur.

Media-Tryck peut vous aider à la composition et à la conception de la thèse si vous le souhaitez, mais dans ce cas, n'oubliez pas de commencer à temps. Ils ont des informations sur l'impression des thèses et proposent également un cours intitulé « Rédaction, mise en forme et présentation d'une thèse au format PDF prêt à imprimer » qui peut être utile sur la voie d'une thèse terminée.

Veuillez noter que les règles concernant la présentation de la thèse s'appliquent quelle que soit l'imprimerie avec laquelle elle a été réalisée.


Voir la vidéo: Automaali - Häivytys (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Keme

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  2. Arashibar

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  3. Varik

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  4. Griswald

    Une bonne opinion, mais tout n'est pas correct, vous avez manqué beaucoup de détails, soyez plus prudent à l'avenir

  5. Penleigh

    D'accord, c'est une pièce remarquable

  6. Mazumuro

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  7. Kulbert

    C'est un message très précieux



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